Dopo due decenni di interesse marginale da parte delle aziende farmaceutiche, le sostanze naturali stanno tornando ad essere una fonte preziosa per la scoperta di nuovi farmaci. Oggi infatti, grazie alle strategie di screening di prodotti naturali che sfruttano i recenti progressi della tecnologia e agli approcci genomici e metabolomici (analisi avanzate che misurano i metaboliti e sono quindi in grado di rivelare il funzionamento del metabolismo di una cellula) in grado di potenziare i tradizionali metodi di studio, si assiste a un rinnovato interesse nei riguardi di tali prodotti.

In un articolo pubblicato su Nature Reviews Drug Discovery, Alan L. Harvey, RuAngelie Edrada-Ebel e Ronald J. Quinn analizzano questo ambito della ricerca farmacologica, riferendo alcuni esempi che riguardano i farmaci antimicrobici e gli inibitori delle interazioni proteina-proteina.

“Ci sono motivazioni forti per rivisitare i prodotti naturali per la scoperta di farmaci – scrivono gli Autori – Storicamente, i prodotti naturali derivati dalle piante e dagli animali sono stati la fonte di quasi tutte le preparazioni di medicinali e, più di recente, hanno continuato a entrare in studi clinici o a fornire le basi per composti in sperimentazione, in particolare gli antitumorali e gli agenti antimicrobici”.

L'analisi dei farmaci approvati dall’FDA tra il 1981 e il 2010 rivela che il 34% di quelli a piccole molecole sono prodotti naturali o derivati diretti; tra questi le statine, gli antitumorali che legano la tubulina e gli immunosoppressori. Il contributo di prodotti naturali sembra impressionante, soprattutto in un contesto in cui l'attenzione delle grandi aziende farmaceutiche è diminuita. Diverse ragioni spiegano questa mancanza di entusiasmo. “Ci sono preoccupazioni legittime – spiegano Harvey e colleghi – che derivano dalla Convenzione delle Nazioni Unite sulla diversità biologica che mira a regolamentare l'accesso internazionale ai prodotti naturali, ma possono essere affrontate seguendo le best practice accettate. Più problematiche erano la convinzione che i prodotti naturali fossero in qualche modo incompatibili con approcci di scoperta di farmaci basati su screening ad elevata efficienza (high throughput screening, HTS) diretti a target molecolari, e le preoccupazioni per le difficoltà connesse all'isolamento ripetuto di composti noti e alla sintesi di prodotti naturali durante la produzione farmaceutica. Ciò si è associato all'aspettativa ancora incompiuta che le tecniche di chimica combinatoria possano fornire tutte le sostanze chimiche necessarie per scoperte di successo. Molte grandi collezioni di screening sono state deludenti nella pratica, ed è noto che la diversità in uno 'spazio chimico' (lo spazio multidimensionale occupato da tutte le sostanze chimiche) biologicamente rilevante è più importante delle dimensioni della libreria. In una certa misura, le librerie di composti sono state progettate per imitare più da vicino le proprietà chimiche di prodotti naturali, sebbene gli stessi prodotti naturali siano generalmente trascurati”.

Le collezioni di prodotti naturali presentano una vasta gamma di farmacofori (molecole con atomi o gruppi chimici in un disposizione spaziale nota per essere o ritenuta responsabile di una attività biologica specifica) e un alto grado stereochimico (disposizione spaziale degli atomi in una molecola), e queste proprietà si prevede contribuiscano alla capacità di tali collezioni di fornire risultati - anche rispetto agli obiettivi di screening più difficili, come le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, i prodotti naturali possono avere l'ulteriore vantaggio rispetto ai composti sintetici di essere metaboliti naturali. Ciò significa che tali composti non solo sono biologicamente attivi, ma è probabile che siano anche substrati per uno o più dei numerosi sistemi di trasporto in grado di fornire i composti al loro sito di azione intracellulare.

“Dati i recenti progressi tecnologici e l’apprezzamento apparentemente crescente dei test funzionali e degli screening fenotipici, i prodotti naturali torneranno in auge tra gli scienziati per la scoperta di farmaci?”- Si chiedono gli Autori. “Ci sono molti esempi di prodotti naturali impiegati negli sforzi di scoperta di nuovi farmaci che sono diretti ad una vasta gamma di indicazioni anche oltre i loro punti di forza tradizionali come l’azione antimicrobica e antitumorale. Ad esempio, alcuni farmaci a base di erbe e composti isolati sono stati testati in modelli di malattia di Alzheimer e di neuropatia diabetica”.

Harvey e colleghi si soffermano innanzi tutto sugli antimicrobici: “I prodotti naturali hanno fornito le basi per la maggior parte delle classi di antibiotici, tra cui i β-lattamici, gli aminoglicosidi, i macrolidi, le tetracicline, le rifamicine, i glicopeptidi, le streptogramine e i lipopeptidi. Dal 2000, sono stati lanciati 22 nuovi antibiotici per uso umano, ma solo cinque di questi rappresentato nuove classi di sostanze. Tre di queste nuove classi hanno la loro origine in prodotti naturali: la daptomicina (lipopeptide), la retapamulina (pleuromutiline) e la fidaxomicina (tiacumicina). Butler e colleghi hanno identificato 56 antibiotici che sono stati sottoposti a test clinici nel 2013. Di questi, diciannove rappresentavano nuovi modelli strutturali e undici riguardavano prodotti naturali. Negli ultimi 30 anni, la ricerca sui prodotti naturali ha anche fornito l'unica nuova classe di farmaci antifungini: le echinocandine. C'è ancora un urgente bisogno di nuovi e migliori anti-infettivi. Il tasso attuale di introduzione di nuovi antimicrobici può non essere sufficiente a far fronte alla comparsa di batteri e funghi che sono resistenti agli attuali antibiotici. La situazione è particolarmente grave nel caso delle infezioni batteriche gram-negative farmaco-resistenti, perché pochissimi nuovi composti sono in fase di sviluppo per tali usi. La domanda è se i prodotti naturali possano essere utili nella ricerca di tali agenti.

L’approccio HTS basato sul target, che con lo sviluppo delle tecnologie genomiche ha scalzato lo screening funzionale tradizionale, ha finora prodotto risultati deludenti. È possibile che la promessa offerta dagli approcci genomici ha deviato l'attenzione dal fatto che lo sviluppo di successo di farmaci antibatterici è sempre particolarmente impegnativo – osservano gli Autori – Gli antibatterici generalmente indurranno lo sviluppo di meccanismi di resistenza nelle specie target, limitando quindi rapidamente l'utilità del farmaco. L'ampia gamma di meccanismi di farmaco-resistenza significa che è sempre più difficile creare nuovi farmaci modificando classi chimiche esistenti. La penetrazione dei composti attraverso pareti batteriche cellulari e in particolare attraverso la membrana esterna supplementare dei batteri Gram-negativi, non è attualmente prevedibile. I composti devono anche evitare i vari meccanismi di efflusso nei batteri. Le concentrazioni plasmatiche di antibiotici generalmente devono essere molto superiori a quelle di altri farmaci per fare in modo che l'antibiotico possa penetrare nei suoi target all'interno della cellula, il che significa che l'antibiotico deve avere un margine di sicurezza eccezionalmente ampio per evitare effetti tossici nel paziente.

Consapevoli di questi ostacoli, molti gruppi di ricerca stanno studiando come fare un uso migliore degli screening che si basano su organismi interi, e non vi è un rinnovato interesse per l'utilizzo di prodotti naturali in screening. Tuttavia, ci sono difficoltà legate alle fonti tradizionali di screening (vale a dire, brodi microbici) a causa della frequente ri-scoperta di composti noti. Sono necessari miglioramenti nella dereplicazione rapida. In alternativa, potrebbero essere testati altri prodotti naturali provenienti da fonti diverse, tra cui prodotti microbici da percorsi criptici attivati o metaboliti secondari da piante, funghi endofitici o fonti marine.

Lo screening della cellula intera può essere utilizzato per determinare i meccanismi di azione antimicrobica individuando i ceppi resistenti, che possono essere successivamente sequenziati per localizzare geni funzionalmente importanti. Utilizzando mutanti farmaco-resistenti, si è scoperto un gruppo di prodotti naturali chiamati acil depsipeptidi in grado di interrompere una proteasi batterica; potenzialmente, questi acil depsipeptidi rappresentano una nuova classe di antibiotici. Collezioni di ceppi di lievito mutanti sono state utilizzate anche per scoprire i meccanismi di azione, e tali approcci hanno avuto successo con estratti di prodotti naturali, come esemplificato dallo screening che ha portato all'isolamento e all’identificazione della parnafungina da una coltura di Fusarium larvarum. La parnafungina ha mostrato ampia attività contro una serie di funghi patogeni, e si è rivelata utile in un modello animale di candidosi.

Un altro approccio funzionale per la scoperta di nuove attività negli screening di cellule intere ha comportato la creazione di profili di modalità d'azione antibiotica (BioMAPs) di 72 antibiotici noti contro 15 ceppi rilevanti di batteri Gram-positivi e negativi. Successivamente, il test BioMAP di 3.120 estratti pre-frazionati da una collezione di prodotti naturali marini ha rivelato 83 frazioni che hanno prodotto nuovi modelli di attività. Lo strumento BioMAP è stato reso disponibile ad altri ricercatori. Sono anche a disposizione informazioni sulle attività di 7.500 composti su cellule di lievito che potrebbero essere attivi nei test fenotipici in altri organismi di riferimento.

Approcci più semplici per lo screening funzionale possono ancora avere successo. Un esempio è un test che identifica gli inibitori del metabolismo batterico dello zucchero, che è stato utilizzato per lo screening di una collezione di oltre 39.000 estratti microbici parzialmente purificati dal Costa Rica contro un ceppo saccarosio-dipendente di Vibrio colera. Un ceppo mutante di V. colera che non trasporta saccarosio è stato utilizzato anche per lo screening degli stessi composti, in modo che gli effetti battericidi e batteriostatici potessero essere distinti. Uno dei 49 successi iniziali è stato seguito con attenzione: si trattava di un nuovo composto attivo contro altre specie Gram-positive, ma resta da valutarne la non tossicità e verificare se la sua potenza piuttosto bassa possa essere migliorata con modifiche strutturali.

Altri test sono stati orientati allo screening delle infezioni in organismi modello, nel nematode Caenorhabditis elegans e nel pesce zebra Danio rerio. Una raccolta di prodotti naturali purificati ha rivelato un tasso di successo più volte superiore a quello di librerie chimiche di sintesi.

Con la crescente consapevolezza della potenza di test funzionali per l'attività antimicrobica, e l'apprezzamento dei vantaggi delle librerie di screening di prodotti naturali, è probabile un aumento nell'uso dei prodotti naturali per trovare sostanze con nuove proprietà antibatteriche o antifungine. Una tendenza simile è stata evidente nell'interesse per la ricerca di composti che influenzano le interazioni tra proteine.

Interazioni proteina-proteina

Interazioni proteina-proteina sono generalmente considerate obiettivi difficili per le “piccole molecole” nonostante tali interazioni svolgano diversi ruoli critici in fisiologia e possano quindi rappresentare importanti bersagli terapeutici.  

Lo screening di prodotti naturali può essere più efficace dello screening di collezioni di composti convenzionali, perché la forma più complessa e le dimensioni maggiori dei prodotti naturali aumentano le possibilità che questi ultimi possano perturbare le interazioni tra grandi aree delle proteine coinvolte. Oltre all'uso di prodotti naturali, altri approcci alla scoperta di farmaci che hanno come target le interazioni proteina-proteina comprendono la progettazione peptidomimetica, la scoperta di farmaci basata sull’utilizzo di frammenti e lo screening virtuale, e questi metodi hanno anche fatto registrare alcuni successi.

In teoria, gli inibitori di interazioni proteina-proteina possono avere più selettività rispetto, per esempio, agli inibitori dei siti attivi degli enzimi, perché potrebbe essere maggiore la diversità strutturale nelle interazioni proteina-proteina che nei siti attivi. Gli inibitori possono bloccare le interazioni legandosi a regioni critiche di una (o più) proteine, o tramite un meccanismo allosterico.

Per quanto riguarda invece gli stabilizzatori delle interazioni proteina-proteina, alcuni di questi composti stabilizzanti sono stati trovati dopo aver notato effetti fenotipici causati da prodotti naturali. Esempi di tali composti includono paclitaxel (che stabilizza i microtubuli), rapamicina (noto anche come sirolimus) e tacrolimus (noto anche come FK506). Sia sirolimus che tacrolimus si legano all’immunofillina FKBP12. Il complesso sirolimus-FKBP12 si lega poi a mTOR (bersaglio della rapamicina nei mammiferi), inibendone così l'attività enzimatica; il complesso tacrolimus-FKBP12 si lega ed inibisce la calcineurina.

L'interazione tra la proteina tumorale 53 e la proteina MDM2 che svolge la funzione di principale inibitore di p53, è servita sia da modello per le interazioni proteina-proteina sia come una sfida per trovare inibitori potenti e selettivi. P53 regola il ciclo cellulare in risposta allo stress e la sua funzione è sregolata in molte cellule tumorali, il che la rende un importante obiettivo terapeutico. È stato rivelato mediante saggi immunoenzimatici (ELISA) e saggi NMR che derivati del prodotto naturale calcone possono disturbare le interazioni p53-MDM2. L’aver passato in rassegna una grande collezione di estratti microbici ha portato all'identificazione di chlorofusina come inibitore dell’interazione p53-MDM2. Clorofusina è una molecola relativamente grande e complessa (anche se di sintesi). Un altro screening di collezioni di composti ha permesso di scoprire inibitori dell’interazione p53-MDM2 più potenti, tra cui la nutlina.

I membri della famiglia di proteine del linfoma a cellule B 2 (BCL-2) regolano l'apoptosi. I membri anti-apoptotici (come ad esempio BCL-X_L), che sono comunemente sovraespressi nelle cellule tumorali, formano un dimero con i membri pro-apoptotici (come BAD o BAX). È stato determinato che due prodotti naturali, gossipolo e purpurogallino, inibiscono il legame di BCL-X_L con il dominio α-elica delle proteine pro-apoptotiche. Gossipolo e i suoi derivati inibiscono la crescita delle linee cellulari del cancro e mostrano attività antitumorale nei modelli animali. Sebbene studi precedenti con gossipolo racemico non abbiano avuto successo, un singolo enantiomero di gossipolo AT-101) è attualmente impiegato in studi clinici in pazienti con diverse forme di cancro.

Conclusioni e prospettive

Anche se i prodotti naturali sono stati ampiamente utilizzati storicamente nella scoperta di nuovi farmaci, ci sono ancora molte risorse che possono essere esplorate nella ricerca moderna. Il Dictionary of Natural Products ha registrato circa 200.000 metaboliti secondari delle piante ad oggi, tra cui circa 170.000 strutture uniche. Circa il 15% dei trial sui farmaci presenti nel database ClinicalTrials.gov si basano su contenuti derivati dalle piante, con circa il 60% di questi farmaci provenienti da 10 “famiglie” tassonomiche. Nonostante questi successi, è probabile che la stragrande maggioranza delle specie vegetali non siano state sistematicamente studiate, anche le medicine tradizionali a base di piante che vengono utilizzate da culture diverse hanno ancora bisogno di essere maggiormente esplorate.

Inoltre, i microrganismi sono prova di una grandezza della biodiversità che supera quelli degli eucarioti, e possono avere eccezionale adattabilità metabolica. Per queste ragioni i microrganismi prosperano anche nelle condizioni ambientali più estreme. Tuttavia, meno dell'1% di questo vasto patrimonio di biodiversità è stato studiato principalmente per la non coltivabilità in laboratorio. Utilizzando tecniche metagenomiche e di espressione eterologa, si è in grado di ottenere un migliore accesso alla comunità microbica ricca di diversità e potenzialmente beneficiare di una fonte illimitata di nuovi composti bioattivi.

Guardando al futuro, i recenti progressi tecnologici potrebbero essere sufficienti a rivitalizzare lo sfruttamento del valore dei prodotti naturali come punti di partenza per la scoperta di farmaci, in particolare rispetto al crescente interesse per lo screening fenotipico. La comprensione delle proprietà fisico-chimiche dei prodotti naturali al fine di favorire lo sviluppo di farmaci non differisce dai normali principi di chimica farmaceutica che si applicano ai composti sintetici.

Questo campo di ricerca è stato arricchito da una vasta gamma di nuovi composti provenienti da fonti non tradizionali, come i nuovi microrganismi. L'introduzione di questi prodotti naturali marini complessi sul mercato ha inoltre messo in evidenza che la chimica dei processi può fornire una quantità sufficiente di molecole, se la loro attività terapeutica è sufficientemente convincente. Questi prodotti naturali marini complessi comprendono farmaci antitumorali come la Monometil auristatin E, che è un analogo sintetico del dolastatin 10 proveniente dalla Dolabella auricularia ed è una componente del brentuximab vedotin; eribulina mesilato che è un analogo dell’alicondrina B proveniente dalla spugna Halichondria okadai; trabectedina, un farmaco derivato dall’ascidia marina Ecteinascidia turbinata; e il farmaco neuropatico ziconotide estratto dalla lumaca marina Conus magus.

Incoraggiare più imprese ad adottare lo screening di prodotti a base naturale, tuttavia, richiede più ricercatori in questo campo, concludono gli autori, per utilizzare in modo efficace i recenti progressi tecnologici.

Leggi l’articolo originale

Pubblicato il: 24 febbraio 2015